در این مقاله بصورت خلاصه در مورد مزایا و معایب تست های تشخیصی پرکاربرد در دوران بارداری (که بدنبال آمنیوسنتز درخواست می شود)می پردازیم ،که شامل:

1- Karyotype

2- FISH

3- QF-PCR

4- MLPA

5- Array CGH

 کاریوتایپ

تکنیکی است که قابلیت ارزیابی تقریباً تمام کروموزوم ها هم از نظر تعدادی (پلوئیدی) و هم اختلالات ساختاری بزرگ (در نوع معمولی تغییرات ساختاری بالای 5 الی 10 مگاباز و در نوع High resolution بالای 3 مگاباز) را می تواند تشخیص دهد.

طی این پروسه کروموزومها بر مبنای طول، محل قرار گیری سانترومر، الگوی باندینگ (کروموزوم ها طی فرآیند رنگ آمیزی بصورت نوارهای روشن و یا تاریک رنگ پذیر مشاهده می شوند)، افتراق کروموزوم های جنسی از کروموزم های اتوزوم (غیر جنسی) و سایر خصوصیات فیزیکی از هم افتراق داده شده و در کنار هم قرار می گیرند.

اختلالات تعدادی نظیر: سندرم داون (تریزومی 21)، سندرم ادوارد (تریزومی 18)، سندرم پاتو (تریزومی 13)، سندرم کلاین فلتر (47,XXY)، سندرم ترنر (45,XO) .

اختلالات ساختاری کروموزومی که سایزی بین 5 تا 10 مگا باز در روش های روتین و حدود 3 مگا باز در روش High Resolution Karyotyping قابل تشخیص است.

از جمله این اختلالات عبارتند از:

– سندرم فریاد گربه (Cri du chat ، قسمتی از بازوی کوتاه کروموزوم 5 حذف شده است که منجر به ایجاد مشکلاتی در ساختار لارنکس و یا حنجره نوزاد می شود)،

– Monosomy 1p36 و یا 1p36 Deletion syndrome (قسمتی از بازوی کوتاه کروموزوم 1 حذف شده است و به آن منوزومی 1p36 هم می گویند. این سندرم منجر ایجاد بیماری صرع مقاوم به درمان می شود که با عقب ماندگی ذهنی، اختلال رشد، هیپوتونی، تشنج، ناتوانی گفتاری، مشکلات بینایی و شنوایی همراه است)،

– سندرم آنجلمن (Angelman syndrome ، حذف یک قطعه بزرگی از بازوی بلند کروموزوم 15 با منشاء مادری که منجر به کوچک شدن سر، ساختار فیزیکی خاص صورت، ناتوانی شدید ذهنی، ناتوانی حرکتی، تشنج، مشکلات حرکتی و تعادلی) و

– سندرم پرایدر- ویلی (Prader-Willi syndrome، حذف یک قطعه بزرگی از بازوی بلند کروموزوم 15 با منشاء پدری که منجر به هیپوتونی عضلانی در نوزاد مبتلا، کاهش شیر خوردن، کاهش فرآیند رشدی).

هیمنطور اختلالات کروموزومی بصورت موزائیسم و ترانسلوکاسیون هم به این روش قابل تشخیص است.

معایب:

– مدت زمان آماده شدن جواب (Diagnosis time) طولانی است (بین 12 تا 18 روز کاری و میانگین 14 روز کاری)، که این طولانی بودن تاریخ جواب بدلیل نیاز به کشت سلول های آمنیوسیت می باشد.

– قادر به تشخیص دایزومی یک والد (Uniparental disomy) نمی باشد (زمانی که فرزند هر دو کروموزوم خود را از یک والد به ارث می‌برد و تنها روش قابل تشخیص در این اختلالات متیلاسیون می باشد)،

– اختلالات مربوط به تک ژن ها قابل تشخیص نیست،

– وابستگی زیادی به مهارت و تجربه انجام دهنده آزمایش (More labor-intensive) دارد.

FISH و یا (Fluorescence in situ hybridization)

جزو تکنیک های سیتوژنتیک مولکولی است، که از یک سری پروب های فلورسنت استفاده می شود که به یک قسمت از سکانس های اسید نوکلوئیک که مکمل این پروب می باشد متصل می شود.

با استفاده از پروب های مخصوص 5 کروموزوم 21، 18، 13، X و Y که عامل 60 الی 80 درصد اختلالات کروموزومی بدو تولد می باشد، قابل تشخیص است.

مزایا:

– مدت زمان آماده شدن جواب کوتاه بوده و به 1 الی 2 روز می رسد.

– با استفاده از پروب های مخصوص لوکوس (قسمتی خاصی از یک ژن در یک کروموزوم)، قابلیت تشخیص حذف های ریز (microdeletion) در سندرم های مربوط به ژن های نزدیک به هم (contiguous gene) را دارد.

– نیاز به کشت سلولی ندارد.

– انواع مختلف نمونه های بیولوژیک می تواند در این روش مورد استفاده قرار گیرد.

– قادر به تشخیص اختلالات ساختاری بین 190 کیلوباز تا 1 مگاباز را دارد.

– قابلیت رد یا تائید جواب های مثبت NIPT، با سرعت و دقت بالا وجود دارد.

معایب:

– قابلیت شناسایی اختلالات کروموزومی ناشناخته را ندارد،

– قادر به تشخیص اختلالات ساختاری کوچکتر از 190 کیلوباز را ندارد،

– قادر به تشخیص دایزومی یک والد (Uniparental disomy) نمی باشد (زمانی که فرزند هر دو کروموزوم خود را از یک والد به ارث می‌برد)

– قادر به تشخیص وارونگی (Inversions) نمی باشد،

– نسبتاً گران می باشد،

– قادر به دریافت سقط قانونی با جواب این روش به تنهایی نمی باشیم،

– به راحتی در کل کشور در دسترس نمی باشد.

QF-PCR

این متد بر اساس تشخیص سریع اختلالات عددی شایع کروموزومی (آنوپلوِئیدی در کروموزمهای 13 ،18 ،21 ، X و Y) را در نمونه هایی که موزائیسم نیستند با دقت و سرعت بالا (حدود 48 ساعت) امکانپذیر مینماید.

بر اساس واکنش فلورسانت کمی زنجیره پلیمراز QF – PCR (‌ Quantitative Flurescent -Polymerase Chain Reacation ) عمل می نماید.

این کیت بر روی نمونه های DNA تخلیص شده از خون، مایع آمنیون، پرزهای کوریونی جفت (CVS) و DNA آزاد داخل مایع آمنیون قابل استفاده میباشد.

قابل ذکر است که انجام آزمایش بر روی نمونه های بافت، خون افراد بالغ و تازه متولد نیز قابل انجام است.

شامل 14 مارکر Short Tandem Repeat (STR)میباشد، که این مارکرها در یک واکنش چندگانه زنجیره پلیمراز (multiplex PCR) تکثیر میشوند.

در نهایت نتایج با استفاده از کاپیلری الکتروفورز مشخص می شوند.

هرچه تعداد مارکرها برای یک کروموزوم بیشتر شود قدرت تشخیص هم افزایش می یابد. این مارکرها مناطق مهم تریزومی کروموزوم ها (critical regions) پوشش میدهند.

مزایا:

– مزیت اصلی این آزمایش ها امکان جواب دهی در زمانی کوتاه است (1 الی 3 روز کاری).

– هم چنین برخورداری از حساسیت و اختصاصیت بالا (در اثر استفاده از چندین مارکر STR)

– قیمت مناسب

معایب:

– محدودیت آزمایش های QF-PCR و MLPA و FISHعدم قدرت تشخیص درجات پایین موزاییسم می باشد.

– هم چنین عدم قدرت تشخیص اختلالات در کروموزوم های دیگر به غیر از کروموزوم های 13، 18، 21، X و یا Y است.

– امکان سقط قانونی به تنهایی توسط این روش امکانپذیر نمی باشد،

MLPA و یا (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

این روش تكثير پروب وابسته به الحاق چندتايي(MLPA) روشي حساس و قدرتمند برای بررسی تغییرات تعداد نسخه (Copy Number Variation) در سطح ژنوم می باشد.

این روش به نحو گسترده در تشخيص طبي و پژوهش پيرامون شناسايي حذفها و تكثيرهاي ژنيِ پاتوژن که مسبب بيماري های ژنتیکی می شود استفاده ميشود.

در این روش با استفاده از مجموعه ای از پروب ها می توان CNV‌ را در بیش از 40 توالی مختلف از ژنوم در یک واکنش مورد بررسی قرار داد.

ابتدا دو پروب مجزا به نواحی اختصاصی از ژنوم (محل هدف) و در مجاور هم هیبرید می شوند٬ بطوریکه فقط به اندازه یک باند فسفو دی استر با هم فاصله دارند.

سپس در مرحله ligation‌ و یا الحاق این دو پروب توسط پیوند فسفو دی استر به هم متصل می شوند. سپس توسط یک جفت پرایمر یونیورسال تکثیر می شود.

سپس محصول الکتروفورز توسط کاپیلری الکتروفورز از هم جدا شده و با مقایسه با نمونه نرمال می توان دوز ژن را در محل اتصال هر جفت پروب را بدست آورد.

بر حسب وجود و یا عدم وجود قطعه تکثیری می توان بصورت کمی تعداد نسخه های ژنی را بدست آورد.

در مقايسه با روش CGH كه تغييرات تعداد نسخه (CNV) را در همه ژنوم تشخيص ميدهد، روشMLPA به بررسي اين تغييرات در مكانهاي كوچك ژنومي مي پردازد.

مزایا:

– بررسی موارد deletion و duplication کروموزومی

– سرعت جوابدهی به کمتر از 24 ساعت

– قادر به تشخیص هر گونه CNV‌ در حد 50 تا 75 نوکلئوتید می باشد و در این میان حتی اگر یک نوکئوتید تفاوت وجود داشته باشد را می تواند از هم تفکیک کند.

– تقریبا مقرون به صرفه است.

– در آن واحد قادر به انجام 60 واکنش همزمان می باشد.

معایب:

– بسیار حسای به مواد آلوده کننده می باشد.

– نیاز به مقدار بالایی DNA‌ برای انجام آزمایش دارد ،

– قادر به شناسایی موتاسیون های نقطه ای ناشناخته نمی باشد.

– قادر به تشخیص پلی مرفیسم های خوش خیم جدید در محل نزدیک به اتصال پروب ها نمی باشد.

– قادر به شناسایی اختلالات مربوط به تمام کروموزوم ها نمی باشد.

– سقط قانونی به تنهایی توسط این تست امکانپذیر نیست.

– قادر به شناسایی انواع موزائیسم ها نمی باشد.

Array CGH

این متد تکنیکی است با قدرت تفکیک بالا که برای شناسایی حذف‌ها و یا اضافه شدگی‌های نامتعادل در کل ژنوم به کار می رود.
در مقایسه با کاریوتیپ از قدرت تفکیک بالاتری برخوردار است.

بسیاری از بیماری ها ناشی از تفاوت در تعداد کپی‌های کروموزمی (Copy Number Variation-CNV) می باشند.

موارد کاربرد آزمایش Array CGH :

– شناسایی سندرم های میکرودلیشنی (ریزحذفی) و میکرودوپلیکیشنی (ریزاضافه شدگی)

– شناسایی نوترکیبی های ساب تلومری و یا سایر نوترکیبی های نامتعادل کروموزومی

– بررسی علل تأخیر تکاملی و عقب ماندگی‌های ذهنی: آنومالی های کروموزومی در 30-25% بیماران مبتلا به تأخیر تکاملی و عقب ماندگی ذهنی یافت می شود.

– آنومالی های مادرزادی چندگانه (نارسایی قلبی، مایکروسفالی اولیه، کوتاهی قد، اختلال در رشد و غیره)

– بیماری های طیف اوتیسم- بخش قابل ملاحظه ای از افراد مبتلا به اوتیسم ایدیوپاتیک دارای حذف ها و مضاعف شدگی های کروموزومی هستند.

– ناهنجاری‌های رفتاری

– علائمی چون صرع و تشنج- CNVهای بیماری زا در 10-5% افراد مبتلا به صرع گزارش شده اند.

– دیسمورفیسم ها- ناهنجاری های کروموزومی دلیل اصلی ویژگی های دیسمورفیک می باشند.

– تشخیص پیش از تولد (PND): Array CGH علاوه بر تشخیص تغییرات عددی کروموزوم ها و آنیوپلوئیدی در مواردی که سابقه تولد فرزند با اختلالات مادرزادی وجود دارد (که عبارت است از افزوده شدن و یا حذف کامل کروموزوم، همچون تریزومی کروموزوم 21 که عامل ابتلا به سندرم داون است.)، در شناسایی تغییرات نامتعادل ساختاری کوچک نیز کارآیی دارد.

– انتخاب پیشرفته جنین (Advanced Embryo Selection) در IVF برای انتخاب جنین قبل از انتقال به رحم مادر (PGS) از این روش استفاده می شود.

– در مطالعات تحقیقاتی و تشخیصی سرطان- تغییرات CNV و SNP توسط کیت های میکرواری قابل شناسایی می باشد.

برتری‌های روش Array CGH

– این روش قادر به آنالیز DNA از تقریباً تمامی بافت ها شامل بافت های بایگانی شده یا بافت هایی که قابل کشت دادن نیستند می باشد.

– تمامی 46 کروموزم انسان در یک آزمایش بررسی می‌شوند.

– در این آزمایش محل دقیق حذف شدگی‌ها و اضافه شدگی‌ها در ژنوم شناسایی می‌شود.

– حساس‌تر و دقیق‌تر از روش‌های کاریوتیپ مرسوم است. این تکنیک قادر به شناسایی حذف‌ها و اضافه شدگی‌های در حد 5 تا 10 کیلو باز است.

– این آزمایش به شناسایی نقاط شکست در عدم تعادل‌‌های کروموزمی شناخته شده می تواند کمک کند.

– کروموزوم های مارکر با این روش شناسایی می شوند.

– بی نیاز بودن از تکنیک‌های زمان‌بر کشت سلولی باعث بالا رفتن سرعت انجام این روش می‌شود.

– Array CGH از تکنیک‌هایی چون FISH و QF-PCR جامع تر است. در تکنیک FISH با توجه به علائم بالینی، صرفاً یک ژن و یا بخش از پیش شناخته ژنوم مورد بررسی قرار می‌گیرد. در حالیکه آزمایش Array CGH بدون توجه به علائم بالینی بررسی تعداد بسیار زیادی از حذف‌ها و اضافه شدگی‌ها را تنها با انجام یک آزمایش امکان پذیر می‌سازد.

– در افرادی که نتایج کاریوتیپ معمولی، طبیعی گزارش شده آزمایش میکرواری می‌تواند عدم تعادل کروموزمی و یا ریز حذف‌ها و مضاعف شدگی‌ها را شناسایی کند.

محدودیت ها

– روش Array CGH قادر به شناسایی جابه‌جایی‌های متعادل کروموزومی و وارونگی ها نیست. در این وضعیت هیچ بخشی از کروموزوم‌ها حذف یا اضافه نمی‌شود و تنها جابه‌جایی بخش‌هایی از کروموزم ها عامل بیماری است.

– موزائیسم با درصد پایین برای تغییرات نامتعادل و آنیوپلوئیدی ها ممکن است با این روش تشخیص داده نشود. حساسیت میکرواری برای تشخیص موزائیسم تحت تأثیر پلت فرم، نوع نمونه، تعداد کپی، کیفیت DNA، کیفیت داده هاو اندازه ناحیه نامتعادل می باشد.

– مکانیسم کروموزومی عدم تعادل ژنتیکی ممکن است آشکار نگردد.

– تتراپلوئیدی یا دیگر پلوئیدی ها ممکن است تشخیص داده نشود و یا به سختی شناسایی گردد.

– ناهنجاری های ناشی از تکرار سه نوکلئوتیدی (trinucleotide repeat expansion disorders) را شناسایی نمی کند.